唾液酸分析的重要性

唾液酸是在聚糖的非還原末端發現的帶負電的單糖。它們對糖蛋白的穩定性和3D構象很重要，并參與許多生物相互作用。唾液酸通常具有關鍵的功能影響：例如，IgG上N-聚糖的唾液酸化增加了抗炎活性；O-乙酰化唾液酸可改變配體相互作用并影響降解（在EPO上發現O-乙酰基化唾液酸，包括Neu5,9Ac2）；唾液酸的存在還通過阻止位于肝細胞上的無唾液酸糖蛋白受體的攝取而增加糖蛋白的血清半衰期。

自然界中發現了多種唾液酸，但生物制藥中N-聚糖和O-聚糖上發現的兩種主要唾液酸是N-乙酰神經氨酸（Neu5Ac，或NANA）和N-甘氨酸（Neu5Gc，或NAGA）。人類無法合成Neu5Gc，其在藥物中的存在可能導致免疫反應，如慢性炎癥。已在正常人血清中檢測到抗Neu5Gc抗體，可中和任何含Neu5Gc的生物藥物，從而降低藥物的療效。重要的是要意識到，細胞系的選擇可以極大地影響生物制藥上存在的唾液酸類型，例如，小鼠IgG上的大部分唾液酸通常是Neu5Gc。

因此，為了藥物的安全性和有效性，必須在產品生命周期的所有階段監測唾液酸的水平和類型，以及QC批次間的一致性。因此，唾液酸分析是ICH Q6B生物制藥特征描述指南中規定的監管要求。

 

使?套件和標準可以獲得的信息

• 唾液酸（Neu5Ac和Neu5Gc）的定量為nmol/mg蛋白質

• O-乙酰化Neu5,9AC2的相對定量

使?試劑盒和標準品進行唾液酸定量分析

唾液酸的釋放

唾液酸通過糖蛋白樣品的溫和酸水解釋放； 通常從一式三份 50 μg 開始，盡管對于唾液酸化水平非常低的樣品可能需要更大的量，例如 單克隆抗體。 我們建議在整個過程中也采取一些過程控制：樣品緩沖液或水作為陰性對照； 胎球蛋白糖蛋白和/或定量糖肽作為陽性對照。 樣品和過程控制與 2M 乙酸在 80°C 下孵育 2 小時。

 

DMB 標簽

為了實現靈敏檢測，釋放的唾液酸隨后用 1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯.2HCl (DMB) 進行熒光標記 - 見圖 1。當唾液酸環打開時，它會在羧酸旁邊暴露一個酮基 ，DMB 結合這兩個相鄰的酮基產生熒光團（其他單糖沒有這些相鄰的酮基，因此它們沒有熒光標記）。 酸水解樣品和過程控制加上 Ludger 唾液酸標準品：Neu5Ac (B491176)、Neu5Gc (B491217)、唾液酸參考組 (S491526) 和 Neu5,9Ac2 (N491192)（如果使用）與 DMB 在 50°C 下孵育 3 小時。

 

液相色譜分析

稀釋 Neu5Ac 和 Neu5Gc 標準品以生成用于定量這兩種唾液酸的標準曲線。 唾液酸參考面板 (S491526) 和 Neu5,9Ac2 用于唾液酸鑒定

 

液相色譜條件

溶劑 A = 乙腈:甲醇:水 9:7:84

溶劑 B = 乙腈

熒光：激發?：373 nm； 發射 ?: 448 nm

柱溫 = 30°C； 樣品溫度 = 10°C

 

 

結果

將樣品中 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的峰面積與標準曲線進行比較，以提供樣品和過程控制中唾液酸含量的定量數據。 圖 2 顯示了從小鼠和人類 IgG 釋放的唾液酸數據。 小鼠 IgG 具有高水平的非人唾液酸 Neu5Gc，在這種情況下，人 IgG 的唾液酸是小鼠 IgG 的 4 倍。 圖 3 顯示了 EPO 中唾液酸的數據。 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的絕對量可以通過與標準曲線比較來確定。 然而，EPO 也含有 O-乙酰化唾液酸 Neu5,9Ac2。 在水性條件下，9 位的乙酸鹽可以遷移到 8 位，因此很難對 Neu5,9Ac2 進行完全定量的標準品。 因此，唾液酸通過與標準品的保留時間進行比較來確定，Neu5Ac、Neu5Gc 和 Neu5,9Ac2 的相對比例由它們的峰面積確定。

 

圖 2：小鼠和人類 IgG 中 Neu5Ac 和 Nue5Gc 的鑒定和定量。

 

圖 3：EPO 中唾液酸的鑒定和定量。